简介：脂质液滴在哺乳动物胚胎和卵母细胞的冷冻保存中起重要作用，但是低温对细胞内脂质液滴的影响以及细胞冷冻损伤的相关机制仍不清楚。最近，俄罗斯研究小组使用拉曼光谱法揭示了细胞中脂质相变的不均匀性，这证实了拉曼技术在研究脂质不均匀性对生物细胞冷冻保存的影响方面是可行的。
在鸡蛋细胞的冷冻保存过程中，除了与水冷冻和冷冻保存剂毒性有关的损坏外，还会发生与细胞结构材料特征的低温变化有关的损害。细胞的脂质结构，例如膜和脂质液滴，容易受到低温损伤的影响。在生理温度下，大多数生物相关的脂质处于液体无序相状的状态。当冷却至低温时，脂质会转变为固体有序相。相变改变了脂质结构的材料特性，包括刚度和扩散速率。因此，这种过渡可能会影响不同细胞器中脂质相关的生物学过程。
当拉曼光谱遇到冻结细胞脂质液滴时：原位而没有标记以捕获脂质相变
细胞膜由具有不同熔点的磷脂的混合物组成。细胞膜的现代模型基于以下假设：具有不同脂质组合物的脂质结构，并且有序的相态高熔合脂质结构在图形上称为“筏”。脂质共存和不同阶段的平衡在调节细胞功能中起着重要作用。温度降低将改变不同脂质相之间的平衡，从而破坏膜功能。膜特性的变化可能是由于温度变化以及水溶作用和冰晶形成的影响，因此膜中的脂质相（LPT）还会影响冷冻保存后的细胞活性。
脂质液滴（LDS）是富含脂质的细胞器，在脂质代谢，细胞信号传导和调节中起重要作用。 LDS的低温变化会影响冷冻保存后哺乳动物卵母细胞的活性。一项实验证明，猪胚胎细胞中的LDS在低温耐药性特征的研究中具有重要作用，即冷冻保存后机电前机械脱水的细胞的存活率从0％增加到50％以上。与磷脂膜类似，LPT发生在细胞冷冻期间。通过与细胞膜类似，可以假定细胞质中的LDS不会在特定温度下单个熔点发生，而是在不同的熔点下逐渐扩散并过渡到脂质。细胞内LD中的LPT可能会干扰细胞功能，但是与LD相关的体温过低的特定机制仍然不清楚，至少到目前为止，尚无清楚的直接证据，表明细胞膜和Frozy细胞中细胞膜和LD的脂质空间分离。
红外光谱法是研究生物细胞中脂质期态的最常用的实验方法，而拉曼光谱法是检测脂质相状态的另一种方法。与红外光谱相比，拉曼散射光谱可以在微观尺度上研究冷冻样品，并以非接触式无标记的方式进行测量。另外，拉曼技术可以抵抗水分子峰的干扰。先前对卵母细胞和胚胎中单LDS的拉曼研究表明，与甘油三酸酯和磷脂系统模型相比，拉曼光谱在检测LPT的发作和扩散方面具有相对较高的精度。连贯的反拉曼散射研究表明，当在富含脂肪酸的培养基中培养时，白色脂肪细胞中的大量LD会在脂质期之间进行分离，这间接表明LPT在不同温度下在不同的脂质下发生。
：拉曼光谱对于研究细胞冻融活性是可行的
2020年8月，俄罗斯科学院自动化与电气科学研究所的团队发表了研究结果，题为“猫中的脂质的拉曼”（图1）[1]。结果表明，脂质在-25°C下在脂质液滴中的两个单独的相状态下并存，并且在检测空间区域中的几微米中具有特定的空间分布，在该空间区域中，高熔点脂质分布在脂质液滴的表面附近，而低融化/融化脂质的内部则深入内部。拉曼光谱技术可以揭示细胞中脂质相变的不均匀性，证实拉曼技术在研究脂质不均匀性对生物细胞冷冻保存的影响方面是可行的。
图1研究结果（照片来源：[1]）
这项研究将卵母细胞用作研究对象，并根据标准冷冻保存使用甘油/丙烯乙二醇（，Pg）作为卵母细胞的冷冻保存。具体而言，冻结协议步骤由四个阶段组成：（i）以1°C/min的冷却速率从室温冷却至-7°C； （ii）用冷铜线接触样品以形成冰芯； （iii）在-7°C下保持10分钟； （iv）以0.3°C/min的冷却速率进一步冷却至-25°C。大多数卵母细胞和胚胎的冷冻过程保持在-7°C，持续10分钟以形成冰核，这是冰结晶的必要阶段，并且在特定的温度下暂停了用于拉曼检测的温度。
拉曼采集平台使用固态激光器（激光波长为532.1 nm），100倍物镜（Na = 0.75），横向分辨率〜0.6 µm，纵向分辨率约为10 µm，光谱分辨率为2.5 cm-1；在扫描模式下测量了一组拉曼光谱，并在指定的坐标处检测到拉曼散射。光谱检测范围为1000至3200 cm-1，暴露时间为3秒；在一次拉曼成像实验中测量了约2500个光谱。初步数据处理包括测量测量光谱中的高能离子宇宙射线，基线校正等。进一步的多元分析包括使用交替的最小二乘算法等数据处理方法，例如奇异值分解和拉曼光谱的非阴性基质分解。
研究结果发现：
1。在不同温度下脂质液滴的拉曼光谱特征具有一定的规律性
如图2所示，在不同的冷冻温度下收集了卵母细胞的拉曼光谱，并且分析了在2882 cm-1处敏感的ACH2键对脂质相变敏感的特征表达，并使用它们的峰来表达在不同温度下的脂质相；通过在〜2850 cm-1处具有强大的拉伸对称CH2（SCH2）峰，可以在拉曼图中鉴定出富含脂质的物质。统计后，不同温度下脂质液滴的光谱特性具有某些规律性。在不同温度下的平均光谱峰：n = 1666@-25℃; n = 1214@-15℃; n = 636@-3℃; n = 478@+5℃; n = 638@+15℃;拉曼光谱在-3℃及以下（图2B）测得（图2B）表明，拉伸的抗对称CH2（ACH2）峰对LPT敏感。以上统计数据表明，LPT开始发生的温度在+5和-3°C之间。
图2不同温度下卵母细胞拉曼光谱的平均光谱（来源：[1]）
注意：（a）在不同温度下对应于卵母细胞中脂质液滴的平均拉曼光谱（-25℃〜+15℃）； CH乐队的拉曼特征区域； （b）表示键在2882时的特征峰。虚线是统计基线。
在低温下的卵母细胞和胚胎中，ACH2峰的强度约为Sch2峰的0.7倍。可能有两种不同的情况，即该峰的强度很低，第一种可能的情况是所有脂质分子处于大致相同的形态状态，随着温度降低，随着温度的降低，逐渐成为更有序的形态状态，这对应于均匀的扩散相过渡。第二种情况涉及脂质分子在有序和无序的相状态下共存，在这种情况下，随着温度的升高，脂质相位状态中脂质的比例降低。
2。拉曼光谱法用于检测冷冻卵细胞中脂质相的不均匀分布
为了确认在LD中是否存在脂质相共存，研究人员将PG用作冷冻保护剂，并在T = -25°C进行10分钟治疗后进行了两个拉曼成像实验：第一个在-25°C下两小时初次暴露后，将甘油作为冷冻机构作为冷冻保护剂进行；第二个用于揭示在其他条件下是否观察到相共存效应。
研究人员使用NMF-ALS方法构建拉曼光谱，将所有拉曼光谱分解为三个光谱成分的线性组合：这些光谱成分对应于有序相脂质（SOL），无序相位脂质（SDL）（SDL）和细胞质（SC）的贡献。相应的SOL在2882 QM-1处具有CH2峰，SCH模式下的拉曼位移为2845 cm-1。 SDL在ACH2处没有显着峰值，而CH2峰为2849 QM-1； SC是冷冻保护剂（甘油或PG，取决于实验条件）和细胞质蛋白的水性混合物。
图3显示了内部有序（IOL）和无序（IDL）相中冻结在-25°C甘油溶液中的脂质（IOL）和无序（IDL）相的脂质图像（3a）和拉曼成像图像（3B）。通过明亮的场显微镜，仍然无法使用脂质的空间分布的不平衡（图3A），但是拉曼成像图表明，不同相状态的脂质在千分尺尺度上分布不均匀（图3B）。根据图3C中脂质光谱1和2的比较，ACH2拉曼峰（IACH）的信噪比估计值大于10。因此，拉曼光谱1和2之间的IACH差异很大。
图3-在25°C的甘油溶液中冷冻卵母细胞中脂质液滴的拉曼光谱图（来源：[1]）
注意：（a）卵母细胞中的明亮场显微镜图像； （b）有序（青色）和无序（红色）状态的脂质的拉曼图； （c）（b）在土武拉曼成像中不同代表点的拉曼光谱，1阶脂质下降区； 2端脂质下降区； 3-胞质。 （d）CH键拉伸区域的相应光谱，1排序的脂质，2个降低脂质，3-胞质。
图4显示了内部有序（IOL）和无序（IDL）相的脂质的亮场图像（4A）和拉曼图（4B和4C），在-25°C中冷冻在丙烯糖溶液中的脂质（IDL）相。 SC的差异与甘油和PG的拉曼光谱有关，因为甘油拉伸的CH带的拉曼光谱仅包含2890和2945 CM-1的两个明显峰，而PG 中的2885、2940和2980 CM-1的峰值有三个峰。值得注意的是，在第二个实验中，平均脂质顺序较高，达到0.31，这与常识相反，因为长期暴露于低温有助于相变到更稳定的状态，因此第一个实验应具有更高的脂质顺序。这种脂质顺序偏差的原因可能是实验中的卵母细胞的来源是不同的，或者是在不同时间，在不同的猫中获得测量中使用的两个卵母细胞，因此可能具有不同的脂质含量。另一个原因可能来自NMF-ALS方法的系统误差，可以注意到，在图3和4中，光谱成分SOL和SDL也有所不同。
图4在-25°C pg溶液中冷冻的猫卵母细胞中脂质液滴的拉克图（来源：[1]）
注意：（a）冷冻卵母细胞的明亮场显微镜图像，矩形，如拉曼光谱研究所研究的区域； （b）有序（IOL青色）和无序（IDL，红色）状态的脂质拉曼图； （c）η的空间分布； （d）通过多元分析获得的拉伸CH区域中的光谱成分（溶解的脂质，SDL降低的脂质，SC-胞质）； （e）脂质阶度η分布的直方图。
3。拉曼光谱法用于监测冷冻卵母细胞中脂质相状态的变化
为了评估脂质期状态的变化，研究中定义了脂质阶级：η= iol/（idl+iol）。在超过最大值20％的所有光谱中，进行了脂质强度的统计数据（图5）。图中的脂质阶数值被广泛分布，可以使用正态分布描述，平均值为η= 0.18。该分布的单峰性表明脂质在有序和无序状态下逐渐分离（图5A）。图5b中显示的η的空间分布表明，脂质的脂质与不同的脂质阶级度为0到0.4，并且η的中间值可能是由于深度分辨率不足以检测到隐藏在某些脂质阶数学的后面的其他脂质。
图5拉曼图（a）和空间分布（b）的直方图（源：[1]）如图2所示
4。“指纹区域”的拉曼光谱成像揭示了脂质液滴中不饱和脂质的分布
通过测量1000-2000 cm-1的“指纹”光谱区域，尽管该区域脂质的拉曼光谱特征峰值比CH拉伸带的峰强度低4倍，但包含更多物质的拉曼带可以提供有关其他化学成分的有效信息。
研究发现，有序相状的脂质将分布在LD的边界上并形成圆形结构，而无序状态的脂质主要位于LD的核心。在图6A（请参阅标记区域）中，至少可以识别出具有环形结构的10个LD。不饱和脂质度的空间分布通过C = C键的比例和-1位置的不饱和脂质中的C = O键的比例为-1。图6中的可视化结果表明，平均IC = C/IC = O比为6.05，对应于每个碳氢化合物链约1.2个双键（图6B）。拉曼光谱对三个成分的分解，并表征有序脂质，无序脂质和细胞质蛋白和冷冻保护剂混合物的贡献（图6C）。 IC = C/IC = O比率范围从5（每条链约1双键）到6.8（每链大约1.35双键）（图6D），分析结果与实际估计值一致。
图6从指纹光谱区获得的-25°C中冷冻溶液中的卵母细胞中脂质液滴的拉曼光谱（来源：[1]）
注意：（a）处于有序状态的脂质拉曼图（IOL）； （b）ic = c/ic = o比率的空间分布; （c）通过多元分析获得的指纹区域中的光谱成分； （d）IC = C/IC = O比分布的直方图。
这项研究使用微拉曼光谱成像来揭示冻结过程中卵母细胞LD的脂质相分离。使用甘油和丙二醇作为冷冻保护剂进行卵母细胞冷冻实验。实验结果证实，脂质根据不同的脂质不饱和度分布在LD中。研究数据还表明，饱和的脂质可能在LD表面经历LPT，而不饱和脂质在LD的核心处保持无序的液相状态。
在许多哺乳动物中，LD会影响细胞活性，细胞内脂质的增加是成功胚胎冷冻保存的主要局限性。尽管已经研究了高脂质含量卵母细胞和植入前胚胎的冷冻保存问题数十年，但是对富含脂质的卵母细胞和胚胎的损害研究很少。脂质重新分布对温度升高到LPT发作后细胞的影响尚不清楚。在有序的相融化后，LD中的大多数脂质可能会混合成均匀的混合物。但是，尚不清楚冻结后混合脂质所需的时间，需要更多的研究来揭示脂质再分配的不同方面及其对冷冻保存后细胞存活和发育的影响。脂质再分配的作用可以在细胞解冻后立即在细胞存活和脂质代谢中起重要作用。拉曼光谱法似乎是研究生物细胞中LPT的一种前瞻性方法，可以提供有关微米尺度脂质分布的信息。这项研究表明，拉曼为研究与LD相关的低温损害机制和制定策略减轻这些损害的机制开辟了新的可能性。
|撰写温金
排版| Qiao
结尾
参考：
[1] VI，KA，SY等。猫中的脂质拉曼。 。 。 2020年8月; 95：177-182。 doi：10.1016/j..2020.03.005。 Epub 2020 3月11日。PMID：。
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